1. Caracterização molecular do milho YieldGard® expressão da proteína Cry1Ab

O milho YieldGard® (MON 810) foi produzido pelo método de biolística ou aceleração de micropartículas ou tecido embriogênico de milho com o plasmídeo PV-ZMBK07. O plasmídeo PV-ZMBK07 contém o gene cry1Ab sob o controle do promotor E35S melhorado (ODELL et al., 1985). A seqüência do gene cry1Ab foi modificada para aumentar a expressão da proteína Cry1Ab em plantas (FISCHHOFF et al., 1987). A construção desse plasmídeo reuniu em um só cassete, além do gene e do promotor, seqüências regulatórias como o íntron do gene hsp70 (proteína de choque de calor; ROCHESTER et al., 1986), a seqüência de finalização da transcrição NOS 3’ (FRALEY et al., 1983), a região alfa do gene lacZ, a seqüência ori-pUC e o gene marcador de seleção nptII (BECK et al., 1982). Esse gene codifica para a enzima neomicina fosfostransferase tipo II (NPTII), a qual confere resistência a antibióticos aminoglicosídicos (canamicina, neomicina e geneticina) que foram utilizados para a seleção das bactérias transformadas com o plasmídeo em questão. O gene cry1Ab codifica a proteína Cry1Ab, que confere à planta a característica de resistência a algumas espécies de insetos da Ordem Lepidoptera. Todos os elementos genéticos mencionados acima foram obtidos de seus respectivos organismos através de técnicas moleculares padrão, sendo esses organismos amplamente caracterizados e estudados.

Com base na caracterização molecular, os seguintes elementos genéticos do plasmídeo PV-ZMBK07 foram identificados no milho YieldGard®: o promotor E35S, o íntron hsp70 e o gene cry1Ab. A seqüência NOS 3' é responsável pela terminação da transcrição, presente no plasmídeo PV-ZMBK07, não foi incorporada no genoma do milho YieldGard®, mas perdida devido a uma quebra na extremidade 3’ do cassete. A proteína nativa Cry1Ab tem peso molecular de 131 kD enquanto que a proteína expressada na planta pelo gene cry1Ab tem um peso molecular de 91 kD, como confirmado em análises de Western blot com extratos de tecido do milho YieldGard®.

A análise de DNA do milho YieldGard® por Southern blot demonstrou que uma única cópia funcional da seqüência do gene cry1Ab foi integrada ao genoma do híbrido de milho receptor. Através de Southern blot também foi mostrado que a seqüência do gene nptII não foi integrada durante o processo de transformação e, portanto, a expressão da proteína NPTII não foi detectada. Na avaliação de progênies, verificou-se que o gene cry1Ab é herdado no padrão Mendeliano esperado e transmitido através do pólen, o que demonstra a integração estável no genoma nuclear. A integridade do inserto foi mantida durante o processo de melhoramento para introdução da Tecnologia YieldGard® em híbridos comerciais de milho.

O nível de expressão da proteína Cry1Ab foi avaliado através de ELISA com amostras de tecidos coletadas nos Estados Unidos (1994 e 1995), na França e Itália (1995 e 1996) e no Brasil (2000). Assim, os resultados obtidos representam o cultivo em ambientes heterogêneos, representativos da cultura do milho e em diferentes safras. Os resultados dos estudos realizados nos Estados Unidos e na União Européia foram apresentados em Sanders et al. (1998). Em resumo, os níveis mais altos da proteína Cry1Ab foram detectados em folhas (entre 4,91 e 12,15 µg/g de peso fresco de tecido). Em planta inteira os valores ficaram entre 3,34 e 4,88 µg/g, e em grãos entre 0,31 e 0,57 µg/g de peso fresco de tecido. Os valores nominais de expressão da proteína Cry1Ab do milho YieldGard® em folhas (10,34 ng/mg de proteína total), grãos (0,19 a 0,39 ng/mg de proteína total) e planta inteira (4,65 ng/mg de proteína total) foram publicados em uma revisão sobre a segurança das culturas Bt (MENDELSOHN et al., 2003). No Brasil, os valores detectados em folhas ficaram entre 10,6 e 16,9 µg/g de peso fresco de tecido de amostras coletadas em diversas datas após o plantio em três locais representativos da cultura do milho (DUDIN et al., 2000). Os níveis da proteína Cry1Ab em tecidos coletados nesses ensaios foram consistentes, o que comprova a estabilidade do inserto também após o melhoramento, o que é um fator importante no desempenho do produto. Os níveis da proteína Cry1Ab encontrados são suficientes para propiciar um controle eficaz das pragas alvo durante toda a safra e isso foi comprovado nos estudos de eficácia realizados com o milho YieldGard®.