6. Segurança ambiental do milho YieldGar®

Uma grande quantidade de informação está disponível sobre a segurança ambiental para organismos não-alvo de formulações microbianas de B. thuringiensis contendo a proteína Cry1Ab. As proteínas Cry1A são extremamente seletivas para os insetos lepidópteros (DULMAGE, 1981; KLAUSNER, 1984; ARONSON et al., 1986; MACINTOSH et al., 1990; WHITELEY e SCHNEPF, 1998), ligando-se a receptores específicos do intestino médio desses insetos (HOFMANN et al., 1988a,b; VAN RIE et al., 1990), sem apresentar efeitos deletérios sobre insetos benéficos e não-alvo, entre os quais se incluem predadores, parasitóides, polinizadores e outros (CANTWELL et al., 1972; KRIEG e LANGENBRUCH, 1981; FLEXNER et al., 1986; UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 1988).

Entretanto, para confirmar e expandir o conhecimento sobre essa proteína, estudos foram conduzidos com o núcleo tripsina-resistente da proteína Cry1Ab, que é o promotor a atividade inseticida. Esses estudos avaliaram os efeitos em organismos não-alvo como: larvas de abelha e abelhas adultas (Apis mellifera L.); larvas da formiga alada (Chrysopa carnea); parasitóide himenóptero (Brachymeria intermedia); joaninha (Hippodamia convergens); minhoca (Eisenia fetida); colêmbolos (Folsomia candida); e pulga-d'água (Daphnia magna). A mortalidade de espécies de insetos não lepidópteros e de organismos representativos expostos à proteína Cry1Ab expressa no milho YieldGard® não difere de forma significativa da mortalidade dos controles. Em todos os casos, o NOEL foi a concentração mais alta testada. A revisão de Mendelsohn et al. (2003) apresenta os mesmos resultados obtidos com organismos não-alvo da proteína Cry1Ab apresentados anteriormente pela Monsanto (Tabela 2).

O efeito do milho YieldGard® sobre organismos não-alvo foi ainda estudado em: três espécies predadoras (Coleomegilla maculata, Orius insidiosus e Chrysoperla carnea) (PILCHER et al., 1997); Folsomia candida e Xenylla grisea (SIMS e MARTIN, 1997); inimigos naturais da Ostrinia nubilalis (ORR e LANDIS, 1997); artrópodos como Aphididae, Cicadellidae, Staphilinidea, Aranea e Coleoptera (Chrysomelidae, Coccinelidae, Staphilinidea), e himenópteros parasitóides e membros da ordem Diptera (Syrphidae) (LOZZIA, 1999); espécies de fitófagos, predadores e detritívoros (MANACHINI et al., 1999); dois colêmbolos de solo (Folsomia fimetaria e Folsomia candida), um ácaro predador de colêmbolos (Hypoaspis aculeifer) e um anelídeo (Enchytraeus crypticus) (KE e KROGH, 2002); pulgões (Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum padi e Sitobion avenae), percevejo (Orius insidiosus), sirfídio (Syrphus corollae), joaninha (Coccinella septempunctata), formiga alada (Chrysoperla carnea), tripes e parasitóides himenópteros (BOURGUET et al., 2002). Esses estudos, de maneira geral, também não demonstraram efeitos do milho YieldGard® sobre os organismos testados.

No Brasil, foram realizados estudos para avaliar a dinâmica populacional de organismos não-alvo em milho YieldGard® como: inimigos naturais (tesourinha, Dermaptera) e pragas secundárias (tripes, pulgão e Diabrótica) (SANTOS et al., 2000); Coccinelídeos, Sirfídeos, Crisopídeos, Orius sp., Geocoris sp. e Doru lineare (FERNANDES et al., 2000); e tesourinha (Doru luteipes), pulgão e tripes (CRUZ, 2000). Os estudos de campo com o milho YieldGard® foram realizados com o híbrido C806 adaptado para o clima tropical para avaliar a dinâmica populacional de insetos pragas e inimigos naturais em comparação ao milho convencional (SANTOS et al., 2000). Esses estudos foram realizados em Rolândia e Ponta Grossa (PR) na safra de verão 1999/2000. Em Rolândia, o milho YieldGard® controlou as lagartas de primeiro e segundo ínstares da Spodoptera frugiperda e da Helicoverpa zea, não demonstrando diferença estatística significativa na abundância de predadores do grupo das tesourinhas (Dermaptera) entre o milho YieldGard® e o milho convencional. Além disso, foi observada menor incidência de grãos ardidos. Em Ponta Grossa, a eficiência do controle foi completa durante toda a safra e até a colheita para as pragas avaliadas. Não houve interferência do tratamento na distribuição dos predadores do grupo das tesourinhas. A ocorrência de pragas secundárias (tripes, pulgão e Diabrótica) foi semelhante no milho YieldGard® e no milho convencional. Estudos para avaliar o controle de lepidópteros pragas e a interação com inimigos naturais presentes na cultura do milho foram realizado em Barretos (SP), Santa Cruz das Palmeiras (SP) e Capinópolis (MG) na safra de verão 1999/2000 (FERNANDES et al., 2000; FERNANDES, 2003). Os resultados indicaram que o milho YieldGard® promoveu eficiente controle de S. frugiperda e H. zea. Adicionalmente, não houve interferência do tratamento sobre o nível populacional do complexo de predadores (Coccinelídeos, Sirfídeos, Crisopídeos, Orius sp. e Geocoris sp.), bem como do predador tesourinha (Doru lineare). Cruz (2000) avaliou o controle de lepidóperos pragas e a interação com inimigos naturais presentes no milho YieldGard® na safrinha de 2000 em Capinópolis (MG). O milho YieldGard® foi eficiente no controle de S. frugiperda, H. zea e Diatraea saccharalis. O controle da S. frugiperda, independente do nível de infestação estudado (20, 30, 40 e 50%) foi eficiente com a utilização do milho YieldGard®. O predador tesourinha (Doru luteipes), que é um importante agente de controle biológico, não foi afetado pelo tipo de tratamento (YieldGard® ou convencional). Populações de pulgão e tripes também não foram diferentes entre os tratamentos.

Ainda no Brasil, o impacto ambiental do milho YieldGard®`` sobre a entomofauna foi também avaliado por Frizzas (2003). A possível interferência sobre os insetos praga, pragas de solo e inimigos naturais foi avaliada, assim como o efeito do MON810 nas interações tritróficas. Uma análise faunística foi realizada pela seleção das espécies de insetos predominantes no milho YieldGard® e no milho convencional seguida de comparação das áreas com base nas espécies encontradas. Esse experimento foi conduzido em Barretos (SP), Rondonópolis (MT) e Ponta Grossa (PR) durante o cultivo do milho ‘safrinha’ e no cultivo de inverno, conforme cada região, por três anos consecutivos (1999, 2000 e 2001). Os levantamentos utilizaram cinco tipos de armadilhas, através das quais foram avaliadas as populações de insetos em toda a área experimental, capturando insetos de hábito diurno, noturno e vespertino. Nesse estudo foi coletado um total de 957.081 espécimes e 409 diferentes espécies. Com base nos resultados, não foram observadas diferenças entre os tratamentos (milho YieldGard®, convencional com inseticida e convencional sem inseticida) com relação ao impacto na comunidade de insetos e à proporção relativa de diferentes guildas tróficas (predadores, parasitóides, polinizadores, decompositores, sugadores e mastigadores). O milho YieldGard® não apresentou efeito sobre a dinâmica populacional das espécies predominantes de aranhas e insetos de diferentes guildas tróficas, incluindo pragas não-alvo e insetos benéficos (Carabidae, Coccinellidae, Chrysopidae, Hemerobiidae, Syrphidae, Tachinidae e Apidae). Avaliações das populações da S. frugiperda e da tesourinha (Doru luteipes) confirmaram que o milho YieldGard® é eficiente no controle da praga e não interfere na dinâmica populacional do predador, respectivamente. A principal conclusão deste estudo foi de que o milho YieldGard® não causa impacto negativo sobre a comunidade de insetos.

Estudos recentes avaliaram o impacto da proteína Cry1Ab e do milho YieldGard® e corroboram com as conclusões anteriores de que organismos não-alvo não são adversamente afetados por essa proteína e pelo YieldGard®. Hanley et al. (2003) avaliaram os efeitos do pólen de milho que expressa a proteína Cry1Ab sobre larvas de abelhas e mediram as mortalidades de larva e pupa, o peso de pupa e a concentração da proteína exógena na hemolinfa de adultos recém emergidos após terem se alimentado de tipos diferentes de pólen. As larvas de abelhas que se alimentaram de pólen convencional ou do milho resistente a insetos não apresentaram diferenças significativas para todos os parâmetros avaliados. Esse resultado é consistente com resultados encontrados anteriormente em experimentos com abelhas (SIMS, 1995). Os efeitos do milho YieldGard® sobre comunidades de besouros (Carabidae e Staphylinidae) e aranhas (Aranaea) foram avaliados em 2003 e 2004 na República Tcheca (HABUSTOVA et al., 2005). Neste caso, tanto a composição da população quanto a abundância relativa de espécies individuais apresentaram diferenças sutis nos três anos, demonstrando que o tipo de milho (YieldGard® e convencional) não produziu efeitos significativos sobre a composição e a abundância das espécies de besouros e aranhas. Assim, concluiu-se que a proteína Cry1Ab expressa no milho YieldGard®, seja nas plantas, nos exudatos no solo e nos resíduos de colheita deixados no campo não afetou os organismos não-alvo estudados.

As aranhas desempenham papel econômico e ecológico importante como predadores de pragas em várias culturas, inclusive o milho, sendo importantes organismos não-alvo a serem estudados para comprovar a segurança ambiental de culturas que expressam proteínas Cry. Um estudo avaliou se o controle biológico realizado pelas aranhas é mais compatível com o milho YieldGard® ou com inseticidas químicos (piretróides) (LUDY e LANG, 2006), ficando demonstrado que o pólen de milho YieldGard® não afetou os parâmetros avaliados das aranhas formadoras de teia, enquanto que o inseticida piretróide teve um efeito adverso bem evidenciado. Em um estudo realizado na Alemanha (MEISSLE e LANG, 2005) as conclusões foram semelhantes às do estudo de Ludy e Lang (2006), mostrando que o milho YieldGard® não teve efeito sobre a riqueza e a abundância das aranhas, enquanto uma única aplicação de piretróide para controle de pragas reduziu significativamente (23-63%) a população desses organismos não-alvo. Além disso, o milho YieldGard® quando comparado ao milho convencional não apresentou efeito sobre a abundância de aranhas. Apesar do alto potencial de exposição das aranhas formadoras de teias ao pólen de milho YieldGard®, os efeitos sobre esse organismo não-alvo são negligíveis.

Inúmeros estudos foram realizados com a lagarta da borboleta Monarca (Danaus plexippus), uma espécie lepidóptera importante e de grande valor cultural nos Estados Unidos, para avaliar os efeitos do milho Bt em sua população. Os resultados de toxicidade em borboletas Monarca conferido por altas doses da proteína Cry1Ab (presumidamente do evento 176) fornecidas em experimentos de laboratório (LOSEY et al., 1999) não significam que esses níveis de exposição ocorrem em situações reais no campo. Esse estudo utilizou um número pequeno de lagartas e não forneceu alimentação alternativa, mas apenas folhas cobertas com grande quantidade de pólen do milho Bt. Esse experimento não quantificou a exposição e não relatou prova de exposição no campo. Assim, gerou não só um resultado questionável, mas também preocupações sobre outros milhos Bt como o milho YieldGard® e o Bt11, que necessitavam de avaliações adicionais. Esse estudo é um exemplo de que o risco foi considerado fora do contexto de exposição e mostra que uma discussão adequada deve considerar a relevância dos resultados (JOHNSON et al., 2006). Diversos estudos subseqüentes foram realizados considerando as condições reais de campo (PIMENTEL e RAVEN, 2000; OBERHAUSER et al., 2001; STANLEY-HORN et al., 2001; SEARS et al., 2001; PLEASANTS et al., 2001; JESSE e OBRYCKI, 2003; O’CALLAGHAN et al., 2005; GATHMANN et al., 2006) e permitiram concluir que a probabilidade do pólen do milho Bt causar impacto expressivo sobre a população das borboletas Monarca é muito pequena, pois não há exposição significativa à proteína Cry1Ab gerada pela presença do milho Bt.

Em 1999 foi realizado um estudo de campo na França para avaliar a abundância temporal de insetos não-alvo no milho YieldGard® (BOURGET et al., 2002). Os insetos estudados foram pulgões (Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum padi e Sitobion avenae), percevejo (Orius insidiosus), sirfídeo (Syrphus corollae), joaninha (Coccinella septempunctata), bicho-lixeiro (Crysoperla carnea), tripes e parasitóides himenópteros. Houve variação do número de indivíduos para todas as espécies, mas não entre os tipos de milho (YieldGard® e convencional). Apenas em um local, tripes foi mais abundante em milho YieldGard®, mas no contexto esse resultado não foi significativo. Os efeitos do milho YieldGard® sobre organismos não-alvo foram avaliados em dois locais na Geórgia, Estados Unidos, em 2001 e 2002 (DALY e BUNTIN, 2005). O único inseto afetado pelo milho YieldGard® foi a lagarta-da-espiga (Helicoverpa zea), que é um inseto alvo. Nesse estudo, foram avaliados: tripes (Frankliniella williamsi); larvas e adultos dos besouros Carpophilus lugubris (na maioria); larvas da mosca Euxesta stigmatis; insetos fitófagos; e predadores (Nabis spp., Geocoris punctipes); aranhas e hooded beetle; pulgas (Chaetocnema publicaria); e pulgões (Orius insidiosus). Esses insetos não foram afetados pelo milho YieldGard®, o que mostra que o milho geneticamente modificado é compatível com os inimigos naturais, os insetos benéficos e outros organismos que ocorrem nos campos de produção.

Os impactos que as proteínas Cry, em geral, poderiam causar sobre insetos e organismos de solo não-alvo têm sido amplamente estudados como parte da avaliação de segurança ambiental de culturas como o milho YieldGard® que expressa a proteína Cry1Ab. Estudos realizados há alguns anos demonstraram que os organismos não-alvo terrestres e de solo testados não foram afetados pela proteína Cry1Ab, mesmo em níveis da proteína muito acima dos níveis máximos que poderiam ser verificados em caso de exposição natural (MACINTOSH et al., 1990; SIMS, 1995; e SANDERS et al., 1998). Um estudo realizado no Zimbabwe mostrou que proteínas Cry produzidas por diferentes subespécies de B. thuringiensis (kurstaki, israelensis e tenebrionis) e a proteína Cry1Ab produzida pelo milho YieldGard® podem persistir em solos tropicais por mais tempo devido à sua ligação às partículas de argila, como também mostrado por outros autores, mas que efeitos sobre a comunidade microbiota de solo não foram observados (MUCHAONYERWA et al., 2004). Uma revisão de Stotzky (2002) concluiu que a proteína Cry1Ab de milho, se presente no solo, não tem efeito adverso sobre minhocas, protozoários, bactérias e fungos, e também não é absorvida por culturas que sucedam o milho resistente a insetos. Em trabalho posterior, o autor chegou a esta mesma conclusão (STOTZKY, 2004). Proteínas Cry de três subespécies de B. thuringiensis não demonstraram atividade microbiocida ou microbiostática contra uma variedade de bactérias, fungos e algas (KOSKELLA e STOTZKY, 2002). Outro estudo avaliou os efeitos do milho YieldGard® e de inseticidas químicos sobre organismos não-alvo (GRIFFITHS et al., 2006). A resistência a insetos resultou em um maior número de nematóides de solo e protozoários (amebas), enquanto a aplicação de inseticida alterou a estrutura da comunidade de nematóides. Esse experimento alcançou basicamente os mesmos resultados de um experimento anterior realizado no campo (GRIFFITHS et al., 2005) que mostrou um efeito do milho YieldGard® dentro da variação normal esperada nos sistemas agrícolas avaliados, já que as populações eram diferentes em cada local avaliado. Os efeitos da proteína Cry1Ab do milho YieldGard® sobre a sobrevivência, reprodução e desenvolvimento de minhocas (Aporrectodea caliginosa) foram avaliados em várias condições experimentais (VERCESI at al., 2006). Essa espécie é abundante em solos agrícolas e é um organismo relevante para testes de segurança sobre os efeitos de plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos sobre organismos não-alvo. A conclusão foi que o milho YieldGard® impõe risco mínimo sobre minhocas, particularmente a espécie A. caliginosa.

Outro ponto importante nas avaliações de segurança ambiental é a persistência da proteína Cry1Ab no solo. Diversos estudos foram conduzidos demonstrando a degradação da proteína Cry1Ab em três sistemas: (1) tecido de milho resistente a insetos sem contato com o solo, (2) tecido de milho resistente a insetos misturado com solo, e (3) proteína Cry1Ab purificada misturada com solo. O estudo de Sims e Holden (1996) avaliou a taxa de degradação da proteína Cry1Ab através da medida da redução da atividade inseticida. A proteína Cry1Ab, como componente do tecido vegetal, tem uma DT50 de 1,6 dias e uma DT90 de 15 dias (tempo para redução de 50 e 90% da bioatividade, respectivamente). Uma publicação mostrou esses mesmos resultados, assim como resultados de degradação da proteína Cry1Ab no tecido sem contato com o solo (DT50 de 25,6 dias e uma DT90 de 40,7 dias) e da proteína purificada no solo (DT50 de 8,3 dias e uma DT90 de 32,5 dias) (MENDELSOHN et al., 2003). Essa taxa de degradação observada no solo é comparável com as taxas observadas para essa mesma proteína e para a Cry1Ac por Palm et al. (1994) e para as formulações microbianas de esporos de Bt (PRUETT et al., 1980; WEST et al., 1984; WEST, 1984). A rápida degradação da Cry1Ab é mais uma característica que mostra que o potencial de efeitos nocivos dessa proteína sobre organismos não-alvo presentes no solo é mínimo ou inexistente. Os resultados dos estudos utilizando a incorporação das proteínas Cry purificadas ou dos tecidos das plantas modificadas com genes cry no solo não demonstraram quantidades substanciais das proteínas Cry intactas no solo (REAM et al., 1992; PALM et al., 1993; PALM et al., 1994; SIMS e HOLDEN, 1996; PALM et al., 1996). No Brasil, a prática agrícola promove a permanência dos restos culturais de milho no campo após a colheita, podendo ser mecanicamente incorporados ou permanecer na superfície do solo. Um estudo sobre a degradação da proteína Cry1Ab foi realizado no Brasil (LAMBAIS, 2000) e procurou determinar quantitativamente a presença dessa proteína em restos culturais do milho YieldGard® através de análises Dot Blot e Western Blot utilizando anticorpos policlonais. Dentro dos limites da metodologia empregada, a proteína Cry1Ab intacta não foi detectada nos restos culturais analisados, o que foi consistente com outros estudos (PALM et al., 1994; SIMS e HOLDEN, 1996). Mais recentemente, a persistência e o acúmulo da proteína Cry1Ab no solo após vários anos de plantio comercial do milho YieldGard® nos Estados Unidos foram avaliados (DUBELMAN et al., 2005). Essa avaliação ocorreu em campos de produção, em cinco regiões nos Estados Unidos, durante três anos consecutivos e mostrou que não há persistência ou acúmulo da proteína Cry1Ab bioativa em solos cultivados repetidamente durante pelo menos 3 safras com híbridos de milho Bt.

Outra questão de cunho ambiental se refere ao fluxo gênico do milho YieldGard® e os efeitos que isso poderia causar. A chance de que haja a polinização cruzada entre uma planta geneticamente modificada (GM) e uma convencional, seguida de introgressão, está relacionada com a disponibilidade e a viabilidade do pólen do parental GM e a entrega desse pólen no estigma do parental convencional. Essa disponibilidade de pólen para a polinização cruzada depende da época de plantio e das condições agronômicas. Já a entrega de pólen no estigma depende do vento, de vetores (como insetos), da distância, de precipitação e de barreiras naturais à movimentação do pólen. A eficiência da polinização cruzada depende ainda da coincidência do tempo de florescimento do parental receptor e do doador, da viabilidade e da capacidade de competição desse pólen. Dependendo do padrão de herança da característica, parte do pólen produzido pelo doador não contém o gene de interesse. Além disso, os grãos de pólen de milho são grandes e pesados, o que reduz as distâncias de dispersão sendo que a maior deposição ocorre próxima à planta doadora (GARCIA et al., 1998; LUNA et al., 2001). A dispersão de 98% do pólen ocorre até 25 m do campo emissor e quase 100% até 100 m de distância. A maior parte (99%) da polinização cruzada fora do campo emissor ocorre a até 18 a 20 m das suas bordas (BROOKES et al., 2004). As condições climáticas (e direção do vento) e as barreiras físicas afetam a dispersão do pólen e a taxa de polinização cruzada do milho, sendo que barreiras mais próximas são mais eficientes. A dispersão de pólen do milho YieldGard® pode, portanto, ser controlada para que a co-existência de plantios convencionais, orgânicos e geneticamente modificados seja possível (BROOKES et al., 2004), assim como já é naturalmente efetuado quando genótipos para diferentes usos (alimentação humana, raças crioulas, etc.) são produzidos em áreas contíguas.

Na União Européia, com o registro de 17 híbridos de milho derivados do milho YieldGard®, são necessárias medidas para que culturas orgânicas, convencionais e geneticamente modificadas co-existam, garantindo o direito de escolha do consumidor e mantendo a contaminação adventícia abaixo do limite atual de 0,3%, determinado pelos países membros (DEVOS et al., 2006). Os fatores que afetam as taxas de cruzamento são: distância entre a fonte de pólen e o organismo receptor; tamanho, forma e orientação do pólen; clima; macho fertilidade e sincronia de florescimento. Portanto, na definição de distâncias de isolamento e/ou barreiras de pólen, todos esses aspectos devem ser considerados gerando regras factíveis e efetivas que garantam a co-existência dos diferentes tipos de cultivo (DEVOS et al., 2005; DEVOS et al., 2006). O fluxo gênico do pólen de milho foi avaliado pela primeira vez na Espanha em situações reais de plantio do milho Bt e do milho convencional (MESSEGUER et al., 2006), mostrando que a co-existência pode ser alcançada pelo estabelecimento de regras simples e claras que considerem a sincronia de florescimento e as distâncias entre os campos de produção, ao contrário do que muitos críticos da tecnologia de plantas geneticamente modificadas divulgam.

A segurança ambiental do milho YieldGard® está provada e ele é considerado seguro para organismos não-alvo. Os inúmeros trabalhos apresentados mostram a variedade de organismos que foram estudados para que essa conclusão fosse tomada. Da mesma forma, estudos e literatura sobre o fluxo gênico e sobre a persistência da proteína Cry1Ab no solo comprovam a segurança do milho YieldGard® no meio ambiente e para os organismos que nele vivem. É importante reforçar que o gene cry1Ab introduzido no milho YieldGard® é oriundo de um organismo abundante em praticamente todos os tipos de solo e que a exposição a esse organismo jamais ocasionou efeitos adversos sobre o meio ambiente.